防己黄芪汤出自张仲景《金匮要略方论》[1]，由防己、黄芪、白术和炙甘草按4∶5∶3∶2比例组成。防己苦寒，可除湿利水消肿，兼能辛散祛风；黄芪补气健脾补肺，尤能固表行水，二药配伍共为君药，补气除湿利水，祛风散邪固表。白术补脾燥湿，既助黄芪补气固表，又助防己祛湿利水，为方中臣药。甘草益气健脾，调和诸药，为方中佐使药。诸药配伍，是治疗水肿之常用方，可用来医治水湿内停及脾肾亏虚之证[2]。目前，防己黄芪汤被大范围的使用在治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎[3]、肾病综合征[4]、慢性肾炎[5]、膝骨关节炎[6]，且该复方富含生物碱类、皂苷类、黄酮类及多糖类等活性成分[7]。多成分定量分析根据结果得出，粉防己碱是防己黄芪汤中含量最高的成分，为该方中重要的物质基础[8]，具有抗炎[9]、抗肿瘤[10]、抗纤维化[11]等药理作用。

  自身免疫性疾病是一种局部或全身性炎症反应的疾病，包括类风湿性关节炎、炎症性肠病及系统性红斑狼疮等，主要影响因素涉及环境、遗传及免疫等 [12] 。已有研究表明， CD4+ T 细胞是自身免疫性疾病中的重要影响因素 [13] 。在一些自身免疫性疾病进展中，辅助性 T 细胞（ helper T cell ， Th ）的功能受一定的影响 [14-15] ；此外，调节性 T 细胞（ regulatory T cell ， Treg ）的活性也被抑制 [16] 。 Treg 可分泌免疫抑制性的细胞因子以维持机体自身免疫耐受，因此，调控 Th 和 Treg 之间平衡是治疗自身免疫性疾病的关键。提示探讨防己黄芪汤对 T 细胞的调控作用有助于阐明防己黄芪汤治疗自身免疫性疾病的机制。

  由于防己黄芪汤组方成分复杂，目前对其质量评价方法大多选择其中几个成分作为质控标准，难以反映复方整体水平，而且对防己黄芪汤有效成分在体内动态过程的研究不全面，但了解这些成分在体内的动态变化，对于揭示防己黄芪汤物质基础和配方规律具备极其重大意义。因此，本研究拟对防己黄芪汤进行多成分表征的质量评价，研究防己黄芪汤在大鼠体内的药动学行为，以揭示其主要入血成分的体内过程；同时，为进一步考察防己黄芪汤的药效基础，从 Th 分化层面探讨该复方在免疫方面的作用，为该复方的后续研究奠定了工作基础。

  体质量（ 270 ± 20 ） g 的清洁级雄性 SD 大鼠和体质量 20 ～ 23 g 的 SPF 级雌性 BALB/c 小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于上海中医药大学动物实验中心，合格证号 SCXK （京） 2012-0001 ，许可证号 SYXK （沪） 2014-0008 。实验前在室温（ 22 ± 2 ）℃、相对湿度 45% ～ 60% 、每天光照 12 h 的条件下适应性饲养 1 周。动物实验操作方法遵循上海中医药大学实验动物伦理委员会相关规定（批准号 201801006 ）。所有动物研究均根据《实验动物护理和使用指南》进行。

  结合防己黄芪汤原方 [1] ，按《方剂学》第 7 版（邓中甲主编）记载，确定其处方组成为防己 1 两（ 12 g ）、 黄芪 1 两 1 分（ 15 g ）、白术七钱半（ 9 g ）、甘草半两（ 6 g ）。分别称取适量防己、黄芪、白术、甘草饮片（ 4 ∶ 5 ∶ 3 ∶ 2 ），加适量水浸泡 30 min ，以 10 倍量蒸馏水煎煮 2 次，每次 1 h ，煎液用 3 层纱布滤过，合并滤液，减压浓缩至适量，于 65 ℃线 目筛，得防己黄芪汤粉末，置于干燥器中保存 [17] 。

  2.2 防己黄芪汤多成分定量分析的超高效液相色谱 - 串联质谱法（UPLC-MS/MS）的建立

  2.2.3 混合对照品溶液和内标储备液的配制 分别精密称取木兰花碱、防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草次酸、黄芪甲苷 7 种对照品适量，置棕色 10 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解并定容， 4 ℃保存，作为对照品储备液。精密称取粉末适量，加甲醇定容至 10 mL ， 4 ℃保存，作为内标储备液。临用前，取一定量的混合对照品储备液，用甲醇稀释成混合对照品溶液（各成分质量浓度分别为木兰花碱 0.75 、 3.75 、 7.50 、 30.00 µg/L ，防己诺林碱 3 、 15 、 30 、 120 µg/L ，粉防己碱 7.5 、 37.5 、 75.0 、 300.0 µg/L ，毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.75 、 3.75 、 7.50 、 30.00 µg/L ，黄芪甲苷 3 、 15 、 30 、 120 µg/L ，甘草苷 1.87 、 9.35 、 18.70 、 74.80 µg/L ，甘草次酸 45 、 225 、 450 、 1 800 µg/L ）。

  2.3.1 专属性考察 分别取大鼠空白血浆＋低质量浓度混合对照品溶液＋内标溶液、给药后 45 min 的血浆样品＋内标溶液、空白血浆＋内标溶液适量，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测。

  2.3.2 线性范围及定量限考察 分别精密吸取一定量的混合对照品储备液，加甲醇稀释，得 7 种不同质量浓度的混合对照品溶液，精密吸取 100 µL ，分别加至 200 µL 的空白血浆中，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测，记录峰面积。以各成分峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（ Y ），各成分的质量浓度为横坐标（ X ），采用加权最小二乘法，权重系数为 1/χ2 ，绘制标准曲线，以信噪比（ S /N ）＝ 10 为定量限。

  2.3.3 精密度和准确度考察 分别精密吸取“ 2.2.3 ”项下 4 种质量浓度的混合对照品溶液 100 µL ，加至 200 µL 的空白血浆中，每个质量浓度平行 5 份，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测， 1 d 内连续测定 3 次，评价日内精密度；连续测定 3 d ，评价日间精密度。

  2.3.4 提取回收率与基质效应考察 取生理盐水 200 µL ，加入 4 种质量浓度的混合对照品溶液 100 µL 和 200 µg/L 内标溶液 50 µL ，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测，测定各成分峰面积，记为 A 。取空白血浆 200 µL ，加入内标溶液 50 µL ，加甲醇 850 µL 涡旋混合 2 min ，离心，取上清液，加入 4 种质量浓度的混合对照品溶液 100 µL ， 37 ℃下氮气吹干，加 20% 甲醇 100 µL 复溶，涡旋 3 min ，离心，吸取上清液，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测各成分峰面积，记为 B 。取空白血浆 200 µL ，加入 4 种质量浓度的混合对照品溶液 100 µL 和内标溶液 50 µL ，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测，测定各待测物的峰面积，记为 C 。计算提取回收率和基质效 应。

  2.3.5 稳定性考察 取大鼠空白血浆 200 µL ，分别加入 4 种质量浓度的混合对照品溶液 100 µL ，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测，考察不同储存条件下（ 4 ℃ 放置 24 h 、 25 ℃ 放置 12 h 、 − 20 ℃ 放置 15 d 、 3 次冻融循环）样品的稳定性。

  按“ 2.2.4 ”项下方法给药、收集样品，测定前于室温溶解血浆样品，涡旋，按“ 2.2.5 ”项下方法处理，按“ 2.2.1 ”“ 2.2.2 ”项下条件检测，所得数据采用 Kinetica 4.4 软件非房室模型分析，计算各成分的达峰时间（ t max ）、达峰浓度（ C max ）、消除半衰期（ t 1/2 ）、药时曲线下面积（ AUC ）、平均驻留时间（ MRT ）、清除率（ CL ）和表观分布容积（ V z ）。

  2.5.1 给药溶液的配制精密称取防己黄芪汤粉末 10 mg ，用 RPMI 1640 培养基溶解并稀释成不同质量浓度的防己黄芪汤药液，使用前经 0.22 μm 微孔滤膜滤过。精密称取粉防己碱 5 mg ，加 1 mol/L HCl 充分溶解并定容至 0.1 mg/L ，精密吸取一定量于量瓶中，加 1 mol/L NaOH 溶液调节 pH 7.2 ，加 RPMI 1640 培养基定容成 0.6 mg/L 粉防己碱溶液，使用前经 0.22 μm 微孔滤膜滤过。

  2.5.2 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 BALB/c 小鼠脊椎脱臼处死，置于 75% 乙醇中消毒灭菌，在生物安全柜中取出脾脏。用玻璃片将脾脏磨碎， 200 目尼龙网滤过，得到的细胞悬液于 4 ℃、 1 000 r/min 离心 5 min （离心半径 10 cm ），弃去上清液。向沉淀细胞中加入一定量的红细胞裂解液，混匀，室温静置 3 min ，离心，弃上清液。加入磷酸盐缓冲液（ pH 7.4 ）重悬， 200 目尼龙网滤过，离心，弃上清液，加入一定量含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基，混匀，在倒置显微镜下对细胞悬液进行计数。

  2.5.4 防己黄芪汤对 T 淋巴细胞增殖的影响 将 T 细胞以 2 × 104 个 / 孔接种于 96 孔板中，平行 6 个复孔，按 100 μL/ 孔加入细胞混悬液，空白组仅加入 RPMI 1640 培养基，对照组和给药组先按 50 μL/ 孔加入 8 mg/L ConA 溶液，给药组再按 50 μL/ 孔加入不同质量浓度（ 100 、 10 、 1 、 0.1 、 0.01 、 0.001 、 1 × 10 −4 、 1 × 10 −5 、 1 × 10 −6 、 1 × 10 −7 mg/mL ）的防己黄芪汤药液，空白组按 50 μL/ 孔加入 RPMI 1640 培养基，于 37 ℃、 5% CO2 恒温培养箱内培养 56 h ，在终止培养前 16 h ，每孔加入 3 H-TdR 20 μL ，使其终浓度为 1 m Ci/mL ，继续培养 16 h 。等标记反应完成后将标记的细胞收集至玻璃纤维膜上滤过，用蒸馏水多次洗涤，把滤纸片放在 80 ℃ 烘箱内烘干后，放入含有脂溶性闪烁液 10 mL 的闪烁杯中，采用闪烁 / 发光计数仪测定样品的每分钟脉冲数（ cpm ）。

  2.5.5 防己黄芪汤对 ConA 诱导的 T 淋巴细胞炎症因子水平的影响 将 T 淋巴细胞以 2 × 106 个 / 孔接种于 6 孔板中，设置对照组、模型组和各给药组，对照组加入 RPMI 1640 培养基，其余各组加入 2 mg/L ConA ，各给药组再加入不同质量浓度（ 0.2 、 1.0 、 5.0 mg/L ）的防己黄芪汤或 0.6 mg/L 粉防己碱，培养 96 h ，于给药后 48 h 收集细胞上清液，采用 ELISA 法测定 IL-2 和 IL-17 水平；于给药后 96 h 收集细胞上清液，测定 IFN-γ 水平。

  3.1.1 专属性 大鼠 ig 防己黄芪汤后血浆样品的 UPLC-MS/MS 图谱见图 1 ，表明该方法拥有非常良好的专属性。

  3.1.2 线性范围及定量限 如表 1 所示，该方法满足血浆样品的测定要求。

  3.1.3 精密度和准确度 如表 2 所示， 7 个成分的日间、日内准确度为 85.14% ～ 105.50% ，日间精密度和日内精密度的 RSD 为 0.2% ～ 10.9% ，符合生物样品的检测要求。

  3.1.4 提取回收率与基质效应 如表 2 所示，各成分的提取回收率为 86.90% ～ 113.04% ，基质效应为 52.33% ～ 112.50% ，其中粉防己碱受基质效应影响较大（ 52.33% ～ 64.76% ），但粉防己碱的回收率较高（ 103.49% ～ 111.68% ），表明血浆中物质只对粉防己碱在质谱中的响应有抑制，因 4 个不同质量浓度的粉防己碱基质效应 RSD ＜ 15% ，说明这种抑制作用可通过建立随行标曲计算浓度抵消，满足分析要求。各成分回收率良好。

  各成分的药时曲线 。木兰花碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、黄芪甲苷和甘草次酸的 AUC0 ～t 和 AUC0 ～∞ 具有剂量相关性趋势；木兰花碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、 甘草苷在体内可被快速吸收并消除 [ t max ＜ 1 h 、 CL ＞ 50 L/(h∙kg) ] ；粉防己碱、防己诺林碱和甘草次酸在大鼠体内消除缓慢 [ CL ＜ 8 L/(h∙kg) ] ，体内驻留时 时间较长（ MRT ＞ 10 h ），表明其在体内具有吸收时间长、消除速度慢、驻留时间长的特点。黄芪甲苷的药时曲线 个峰的 t max 为 0.5 h ，第 2 个峰的 t max 为 4 h ；第 1 个峰的吸收和消除速率均比第 2 个快，在其他含有黄芪的中药复方中也出现了此现象 [18] ，但黄芪甲苷单体和黄芪提取物中黄芪甲苷的药动学研究并未发现有双峰现象 [19-20] ，推测黄芪甲苷的吸收、消除等过程易受复方中其他成分的影响。粉防己碱是防己黄芪汤入血最多的生物碱， ig 不同剂量的粉防己碱是为了对比单一给药和复方给药时粉防己碱药动学的区别，探索复方是否有增进粉防己碱入血的作用。实验中采用的粉防己碱给药剂量根据防己黄芪汤给药剂量折算。与单一成分给药相比，防己黄芪汤中的粉防己碱的吸收程度显著增加，而消除速率明显降低。

  3.3. 1 防己黄芪汤对T 淋巴细胞毒性的影响 如表5 所示，防己黄芪汤在1 ×10 −7 ～100 mg/L 对T 淋巴细胞无明显细胞毒性作用。

  3.3.3 防己黄芪汤对ConA 诱导的T 淋巴细胞炎症因水平的影响 如表7 所示，与对照组比较，模型组细胞上清液中IL-2 、IFN-γ 和IL-17 水平均明显升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，防己黄芪汤高剂量组细胞上清液中IL-2 、IFN-γ 和IL-17 水平均明显降低（P ＜0.05 、0.01 ），防己黄芪汤中剂量组IL-17 水平明显降低（P ＜0.01 ），防己黄芪汤低剂量组IL-2 和IL-17 水平明显降低（P ＜0.05 、0.01 ），粉防己碱组IL-17 水平明显降低（P ＜0.01 ）。

  3.3.4 防己黄芪汤对ConA 诱导的T 淋巴细胞Treg 数目的影响 如表7 所示，与对照组比较，模型组CD4+ CD25+Foxp3+ 细胞比例明显升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，粉防己碱组和防己黄芪汤中、高剂量组CD4+ CD25+Foxp3+ 细胞比例非常明显升高（P ＜0.05 、0.01 ）。

  目前关于防己黄芪汤中黄酮类和皂苷类成分的药动学研究报道较少，本研究建立了同时测定大鼠血浆中木兰花碱、防己诺林碱和粉防己碱等 7 个成分含量的UPLC-MS/MS 分析方法。通常情况下，进入体循环的成分才有机会是中药复方的药效物质。研究表明，防己诺林碱、木兰花碱、黄芪甲苷、甘草次酸和粉防己碱具有抗炎作用[21-24] ，这些成分可能是防己黄芪汤发挥抗炎作用的重要物质基础。此外，防己黄芪汤中木兰花碱、黄芪甲苷、甘草次酸和粉防己碱的吸收表现出了剂量相关性，这与防己黄芪汤产生剂量相关性的抗炎药效相关[25] 。

  中药复方中活性成分的药时曲线呈现双峰是较为普遍的现象。造成此现状的原因可能有以下几种： ① 肝肠循环，经胆汁排入肠道的原型药物或者代谢物被肠黏膜重新吸收，由肝门静脉进入肝脏[26] ；② 胃排空和小肠转运异常[27] ；③ 特定吸收位置[28] ；④ 药物剂型因素[29] 。黄芪甲苷的药时曲线呈双峰现象，此现状也同样发生在其他含有黄芪的中药复方中[17] ，但关于黄芪甲苷单体和黄芪提取物中黄芪甲苷的药动学研究并未发现有双峰现象[30] ，推测黄芪甲苷的药动学行为易受复方中其他成分的影响。除黄芪甲苷外，防己黄芪汤中的其他成分也会相互影响。细胞色素P450 （cytochrome P450 ，CYP ）3A 是人体肝脏和小肠中最丰富的CYP 酶之一，其代谢介导的化合物的药动学特性会因药物相互作用而发生改变[31] 。研究表明，粉防己碱的代谢过程需要CYP3A4 和CYP3A5 的参与[32] 。粉防己碱水溶性较差、生物利用度较低[33] ，而本研究表明防己黄芪汤给药时可提升粉防己碱的生物利用度，此现象表明粉防己碱与复方中其他成分有几率存在协同作用。甘草次酸是甘草酸具有药理活性的主要代谢物，研究显示，甘草次酸是CYP3A4 的抑制剂[34] ，因此，推测甘草次酸可能会通过CYP3A4 抑制粉防己碱的代谢过程，减缓其消除速率，增加其在体循环中的暴露量，从而增加防己黄芪汤中粉防己碱的生物利用度。

  此外，本研究之后发现防己黄芪汤能抑制 T 淋巴细胞增殖，并下调炎性细胞因子水平，对于免疫疾病的临床应用具备极其重大意义。FoxP3 是Treg 的关键和特异性转录因子，是增加Treg 活性的先决条件[35-37] 。 本研究结果为防己黄芪汤能够在一定程度上促进CD4+ CD25+ FoxP3+Treg 的分化，表明防己黄芪汤可能通过促进Treg 的分化，从而抑制ConA 诱导的T 淋巴细胞的增殖。因此，Treg 可能是防己黄芪汤治疗疾病的关键。防己黄芪汤主要入血成分粉防己碱可在体外诱导Treg 分化，这与其他研究者的结论一致[38] ，因此，粉防己碱可能是防己黄芪汤发挥疾病治疗的关键药效物质。

  综上，大鼠 ig 防己黄芪汤后血液中的主要成分有木兰花碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、黄芪甲苷、甘草次酸和粉防己碱，且粉防己碱与复方中的其他成分存在着协同作用，可提高该成分的生物利用度，体现了中药配伍的合理性和科学性。另外，本研究还考察了防己黄芪汤及其主要入血成分粉防己碱对T 淋巴细胞分化的调节作用，发现Treg 可能是防己黄芪汤治疗免疫性疾病的关键免疫细胞，而粉防己碱在其中发挥重要作用。

  来 源：吕春明，侯 婷，张 宁，王 冰．防己黄芪汤在大鼠体内的药动学研究及其对T淋巴细胞的调节作用 [J]. 中草药, 2024, 55(3): 861-871.

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